摘要：研究針對胸腺中MHC-I限制性CD8+T細胞如何獲得不同功能（輔助、細胞毒、先天記憶）這一核心問題展開。
在我們身體的免疫司令部——胸腺中，未成熟的T細胞前體經(jīng)歷一場嚴格的“選拔”才能成為合格的免疫戰(zhàn)士。其中，CD8+T細胞通常被認為是專職的“殺手”細胞，負責清除被病毒感染或癌變的細胞。然而，免疫系統(tǒng)遠比我們想象的復雜，CD8+T細胞這個群體內(nèi)部其實也存在分工：有的確實是效應細胞毒性T細胞（Cytotoxic T cell, CTL），但有的卻表現(xiàn)出類似CD4+輔助性T細胞（Helper T cell）的功能，甚至還有一類具備“先天記憶”（Innate memory, IM）特性，能夠更快速地響應威脅。長期以來，一個核心的謎團困擾著免疫學家：這些功能迥異的CD8+T細胞亞群是如何在胸腺這個“訓練營”中被塑造出來的？是什么決定了它們不同的命運？
傳統(tǒng)的觀點認為，T細胞的譜系命運（是成為輔助性還是細胞毒性T細胞）主要取決于其T細胞受體（T cell receptor, TCR）識別的是主要組織相容性復合體II類（MHC-II）還是I類（MHC-I）分子。然而，近年來的“動力學信號模型”提出了更精細的調(diào)控機制：命運并非由共受體（CD4或CD8）本身決定，而是由TCR信號在陽性選擇過程中的“持續(xù)性”決定的。持續(xù)的信號會誘導輔助性T細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子ThPOK，推動細胞向輔助性譜系分化；而中斷的信號則會允許細胞因子誘導細胞毒性T細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx3d表達，推動向細胞毒性譜系分化。但是，是什么控制了TCR信號的這種“持續(xù)性”或“中斷”呢？特別是對于所有都被MHC-I分子選擇的CD8+T細胞來說，其內(nèi)部的功能差異又是如何產(chǎn)生的？這背后是否與它們所識別的具體“身份證”——即由MHC-I分子呈遞的特定胸腺肽有關？
圖1 解析CD8譜系命運決定：揭示功能各異的CD8+ T細胞由不同MHC-I胸腺肽選擇形成
為了深入探究MHC-I限制性CD8+T細胞的譜系命運決定機制，由Miho Shinzawa和Alfred Singer等人組成的研究團隊在《Nature Immunology》上發(fā)表了他們的最新研究。他們設計了一個巧妙的遺傳學模型——CD8Dual小鼠。這種小鼠的Cd4和Cd8基因座都編碼CD8共受體蛋白，但分別產(chǎn)生略有差異的CD8.1（由Cd4基因座編碼）和CD8.2（由Cd8基因座編碼）共受體。這一設計使得研究人員能夠剝離共受體蛋白本身的功能，而專注于研究編碼這些共受體的基因座（Cd4 或 Cd8）對TCR信號動力學和細胞命運的固有影響。
研究人員主要運用了基因工程小鼠模型構(gòu)建、流式細胞術（Flow Cytometry）進行免疫表型分析、體外T細胞功能刺激實驗、RNA測序（RNA-seq）進行轉(zhuǎn)錄組分析、實時定量PCR（RT-qPCR）、以及通過 Rag-GFP 報告基因追蹤胸腺細胞發(fā)育時序等關鍵技術方法。
CD8Dual小鼠揭示Cd4與Cd8基因座導向不同的CD8+T細胞功能譜系
在CD8Dual小鼠胸腺和外周淋巴器官中，表達CD8.1共受體的T細胞和表達CD8.2共受體的T細胞均是由MHC-I分子選擇產(chǎn)生的。然而，它們卻走上了截然不同的道路。CD8.1 T細胞高表達輔助性T細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子ThPOK，其轉(zhuǎn)錄譜和分子表達模式與野生型小鼠的CD4+輔助性T細胞相似。功能上，在體外刺激后，它們能上調(diào)輔助性分子CD40L，并能在TH2極化條件下產(chǎn)生IL-4。更重要的是，在CD8Dual小鼠胸腺內(nèi)，也存在由CD8.1 T細胞分化而來的調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）和恒定自然殺傷T細胞（iNKT）各亞群（NKT1, NKT2, NKT17）。相反，CD8.2 T細胞則高表達細胞毒性T細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx3d，其特性與野生型小鼠的CD8+細胞毒性T細胞類似，在刺激后能產(chǎn)生IFN-γ和顆粒酶B（Granzyme B），并且在淋巴耗竭環(huán)境下具有更強的增殖能力。這些結(jié)果清晰地表明，即使表達的均是CD8共受體，由Cd4基因座編碼的共受體傾向于推動T細胞向輔助性譜系分化，而由Cd8基因座編碼的共受體則傾向于推動向細胞毒性譜系分化。
共受體動力學與陽性選擇中的TCR信號持續(xù)時間
那么，Cd4和Cd8基因座是如何造成這種差異的呢？答案在于它們對共受體表達動力學的調(diào)控不同，進而影響了TCR信號的持續(xù)時間。研究人員通過分析胸腺細胞陽性選擇不同階段（通過CD69和CCR7表達劃分）的共受體表達和信號強度指標（如CD5），發(fā)現(xiàn)CD8.2（Cd8基因座編碼）的表達在TCR信號后急性下降，而CD8.1（Cd4基因座編碼）的表達則穩(wěn)步上升。這與“動力學信號模型”中Cd8基因表達會瞬時終止的概念一致。重要的是，依賴于Cd4編碼的CD8.1共受體的MHC-I TCR信號是持續(xù)性的，這誘導了ThPOK的表達；而依賴于Cd8編碼的CD8.2共受體的TCR信號則發(fā)生了中斷，從而允許Runx3d的表達。成熟T細胞上CD5和Nur77（TCR信號強度指標）的表達水平差異也印證了這一點，CD8.1 T細胞始終表現(xiàn)出更強的信號痕跡。
不同MHC-I胸腺選擇肽選擇功能不同的CD8+T細胞
接下來，研究團隊探索了更根本的問題：是什么初始因素決定了TCR信號的持續(xù)性或中斷？他們將目光投向了TCR識別的對象——胸腺肽。胸腺肽主要由胸腺皮質(zhì)上皮細胞（cTEC）加工產(chǎn)生。其中，cTEC特有的胸腺蛋白酶體（含有β5t亞基）產(chǎn)生β5t肽，而其他蛋白酶體則產(chǎn)生非β5t肽。關鍵區(qū)別在于，β5t肽僅存在于cTEC，而非β5t肽在胸腺內(nèi)廣泛表達（包括cTEC和皮質(zhì)髓質(zhì)交界處/髓質(zhì)細胞）。
通過比較β5t基因野生型（β5tWT）和敲除型（β5tKO）的CD8Dual小鼠，研究人員有了驚人發(fā)現(xiàn)：CD8.1輔助性T細胞的產(chǎn)生完全不受β5t缺失的影響，說明它們完全由非β5t肽選擇。而CD8.2細胞毒性T細胞的產(chǎn)生則部分依賴于β5t肽（在β5tKO小鼠中減少約50%），表明它們可由β5t肽和非β5t肽共同選擇。進一步分析發(fā)現(xiàn)，由β5t肽選擇的CD8.2 T細胞是常規(guī)的細胞毒性T細胞（CV, Runx3+Eomes-），而在β5tKO小鼠中殘存的、由非β5t肽選擇的CD8.2 T細胞則幾乎全是先天記憶樣T細胞（IM, Runx3+Eomes+）。IM細胞的生成依賴于IL-4，并在PLZFKO或CD1dKO（缺乏iNKT細胞）小鼠中被廢除。通過Rag-GFP報告基因分析發(fā)育時序，發(fā)現(xiàn)IM CD8+T細胞的出現(xiàn)比CV細胞晚約10小時，且CD5表達更高，提示其接受了由非β5t肽在胸腺皮質(zhì)外區(qū)域（如髓質(zhì)）引發(fā)的“晚期TCR信號”。這種晚期信號可能延遲了胸腺細胞的遷出，使其有更多時間暴露于由NKT2細胞產(chǎn)生的IL-4中，從而促進IM表型的獲得。
圖2 CD8Dual小鼠的表征
機制在野生型小鼠中的普適性
為了驗證這一機制并非CD8Dual小鼠特有，研究團隊在野生型BALB/c和C57BL/6（B6）小鼠中進行了驗證。在富含IL-4和NKT2細胞的BALB/c小鼠中，β5t的缺失同樣幾乎完全廢除了CV CD8+T細胞的生成，但不影響IM CD8+T細胞。而在缺乏IL-4、IM CD8+T細胞本就極少的B6小鼠中，β5t缺失也主要影響CV細胞的生成。這表明，不同胸腺肽選擇不同功能CD8+T細胞的機制是普遍存在的，而不同品系小鼠胸腺內(nèi)細胞因子環(huán)境（如IL-4水平）的差異決定了IM細胞群體的規(guī)模。
研究結(jié)論與意義
本研究得出了顛覆性的結(jié)論：CD8+T細胞的功能命運并非預先注定，而是在胸腺陽性選擇過程中，由特定MHC-I胸腺選擇肽通過調(diào)控TCR信號持續(xù)時間來精確決定的。β5t肽由于其局限于胸腺皮特的分布，其介導的TCR信號在胸腺細胞離開皮質(zhì)時必然中斷，從而專一性地產(chǎn)生細胞毒性CD8+T細胞。而非β5t肽因其在胸腺內(nèi)廣泛分布，使得TCR信號有可能持續(xù)（誘導輔助性命運）或在皮質(zhì)外重現(xiàn)（“晚期信號”，與IL-4協(xié)同誘導先天記憶命運）。因此，是肽在胸腺內(nèi)的“空間分布”特性，而非其絕對的序列特征，最終決定了其所選擇的CD8+T細胞的功能屬性。
這項研究成功地整合了T細胞識別的肽特異性、T細胞的功能獲得以及胸腺細胞的遷移過程這三個關鍵維度，為理解胸腺中CD8+T細胞功能異質(zhì)性的起源提供了全新的框架。它不僅深化了對T細胞發(fā)育生物學的認識，也對未來旨在定向調(diào)控T細胞功能（例如，在腫瘤免疫治療或自身免疫病干預中）的策略提供了重要的理論基礎。
參考資料
[1] Unraveling CD8 lineage decisions reveals that functionally distinct CD8+ T cells are selected by different MHC-I thymic peptides
摘要：研究針對胸腺中MHC-I限制性CD8+T細胞如何獲得不同功能（輔助、細胞毒、先天記憶）這一核心問題展開。
在我們身體的免疫司令部——胸腺中，未成熟的T細胞前體經(jīng)歷一場嚴格的“選拔”才能成為合格的免疫戰(zhàn)士。其中，CD8+T細胞通常被認為是專職的“殺手”細胞，負責清除被病毒感染或癌變的細胞。然而，免疫系統(tǒng)遠比我們想象的復雜，CD8+T細胞這個群體內(nèi)部其實也存在分工：有的確實是效應細胞毒性T細胞（Cytotoxic T cell, CTL），但有的卻表現(xiàn)出類似CD4+輔助性T細胞（Helper T cell）的功能，甚至還有一類具備“先天記憶”（Innate memory, IM）特性，能夠更快速地響應威脅。長期以來，一個核心的謎團困擾著免疫學家：這些功能迥異的CD8+T細胞亞群是如何在胸腺這個“訓練營”中被塑造出來的？是什么決定了它們不同的命運？
傳統(tǒng)的觀點認為，T細胞的譜系命運（是成為輔助性還是細胞毒性T細胞）主要取決于其T細胞受體（T cell receptor, TCR）識別的是主要組織相容性復合體II類（MHC-II）還是I類（MHC-I）分子。然而，近年來的“動力學信號模型”提出了更精細的調(diào)控機制：命運并非由共受體（CD4或CD8）本身決定，而是由TCR信號在陽性選擇過程中的“持續(xù)性”決定的。持續(xù)的信號會誘導輔助性T細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子ThPOK，推動細胞向輔助性譜系分化；而中斷的信號則會允許細胞因子誘導細胞毒性T細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx3d表達，推動向細胞毒性譜系分化。但是，是什么控制了TCR信號的這種“持續(xù)性”或“中斷”呢？特別是對于所有都被MHC-I分子選擇的CD8+T細胞來說，其內(nèi)部的功能差異又是如何產(chǎn)生的？這背后是否與它們所識別的具體“身份證”——即由MHC-I分子呈遞的特定胸腺肽有關？
圖1 解析CD8譜系命運決定：揭示功能各異的CD8+ T細胞由不同MHC-I胸腺肽選擇形成
為了深入探究MHC-I限制性CD8+T細胞的譜系命運決定機制，由Miho Shinzawa和Alfred Singer等人組成的研究團隊在《Nature Immunology》上發(fā)表了他們的最新研究。他們設計了一個巧妙的遺傳學模型——CD8Dual小鼠。這種小鼠的Cd4和Cd8基因座都編碼CD8共受體蛋白，但分別產(chǎn)生略有差異的CD8.1（由Cd4基因座編碼）和CD8.2（由Cd8基因座編碼）共受體。這一設計使得研究人員能夠剝離共受體蛋白本身的功能，而專注于研究編碼這些共受體的基因座（Cd4 或 Cd8）對TCR信號動力學和細胞命運的固有影響。
研究人員主要運用了基因工程小鼠模型構(gòu)建、流式細胞術（Flow Cytometry）進行免疫表型分析、體外T細胞功能刺激實驗、RNA測序（RNA-seq）進行轉(zhuǎn)錄組分析、實時定量PCR（RT-qPCR）、以及通過 Rag-GFP 報告基因追蹤胸腺細胞發(fā)育時序等關鍵技術方法。
CD8Dual小鼠揭示Cd4與Cd8基因座導向不同的CD8+T細胞功能譜系
在CD8Dual小鼠胸腺和外周淋巴器官中，表達CD8.1共受體的T細胞和表達CD8.2共受體的T細胞均是由MHC-I分子選擇產(chǎn)生的。然而，它們卻走上了截然不同的道路。CD8.1 T細胞高表達輔助性T細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子ThPOK，其轉(zhuǎn)錄譜和分子表達模式與野生型小鼠的CD4+輔助性T細胞相似。功能上，在體外刺激后，它們能上調(diào)輔助性分子CD40L，并能在TH2極化條件下產(chǎn)生IL-4。更重要的是，在CD8Dual小鼠胸腺內(nèi)，也存在由CD8.1 T細胞分化而來的調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）和恒定自然殺傷T細胞（iNKT）各亞群（NKT1, NKT2, NKT17）。相反，CD8.2 T細胞則高表達細胞毒性T細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx3d，其特性與野生型小鼠的CD8+細胞毒性T細胞類似，在刺激后能產(chǎn)生IFN-γ和顆粒酶B（Granzyme B），并且在淋巴耗竭環(huán)境下具有更強的增殖能力。這些結(jié)果清晰地表明，即使表達的均是CD8共受體，由Cd4基因座編碼的共受體傾向于推動T細胞向輔助性譜系分化，而由Cd8基因座編碼的共受體則傾向于推動向細胞毒性譜系分化。
共受體動力學與陽性選擇中的TCR信號持續(xù)時間
那么，Cd4和Cd8基因座是如何造成這種差異的呢？答案在于它們對共受體表達動力學的調(diào)控不同，進而影響了TCR信號的持續(xù)時間。研究人員通過分析胸腺細胞陽性選擇不同階段（通過CD69和CCR7表達劃分）的共受體表達和信號強度指標（如CD5），發(fā)現(xiàn)CD8.2（Cd8基因座編碼）的表達在TCR信號后急性下降，而CD8.1（Cd4基因座編碼）的表達則穩(wěn)步上升。這與“動力學信號模型”中Cd8基因表達會瞬時終止的概念一致。重要的是，依賴于Cd4編碼的CD8.1共受體的MHC-I TCR信號是持續(xù)性的，這誘導了ThPOK的表達；而依賴于Cd8編碼的CD8.2共受體的TCR信號則發(fā)生了中斷，從而允許Runx3d的表達。成熟T細胞上CD5和Nur77（TCR信號強度指標）的表達水平差異也印證了這一點，CD8.1 T細胞始終表現(xiàn)出更強的信號痕跡。
不同MHC-I胸腺選擇肽選擇功能不同的CD8+T細胞
接下來，研究團隊探索了更根本的問題：是什么初始因素決定了TCR信號的持續(xù)性或中斷？他們將目光投向了TCR識別的對象——胸腺肽。胸腺肽主要由胸腺皮質(zhì)上皮細胞（cTEC）加工產(chǎn)生。其中，cTEC特有的胸腺蛋白酶體（含有β5t亞基）產(chǎn)生β5t肽，而其他蛋白酶體則產(chǎn)生非β5t肽。關鍵區(qū)別在于，β5t肽僅存在于cTEC，而非β5t肽在胸腺內(nèi)廣泛表達（包括cTEC和皮質(zhì)髓質(zhì)交界處/髓質(zhì)細胞）。
通過比較β5t基因野生型（β5tWT）和敲除型（β5tKO）的CD8Dual小鼠，研究人員有了驚人發(fā)現(xiàn)：CD8.1輔助性T細胞的產(chǎn)生完全不受β5t缺失的影響，說明它們完全由非β5t肽選擇。而CD8.2細胞毒性T細胞的產(chǎn)生則部分依賴于β5t肽（在β5tKO小鼠中減少約50%），表明它們可由β5t肽和非β5t肽共同選擇。進一步分析發(fā)現(xiàn)，由β5t肽選擇的CD8.2 T細胞是常規(guī)的細胞毒性T細胞（CV, Runx3+Eomes-），而在β5tKO小鼠中殘存的、由非β5t肽選擇的CD8.2 T細胞則幾乎全是先天記憶樣T細胞（IM, Runx3+Eomes+）。IM細胞的生成依賴于IL-4，并在PLZFKO或CD1dKO（缺乏iNKT細胞）小鼠中被廢除。通過Rag-GFP報告基因分析發(fā)育時序，發(fā)現(xiàn)IM CD8+T細胞的出現(xiàn)比CV細胞晚約10小時，且CD5表達更高，提示其接受了由非β5t肽在胸腺皮質(zhì)外區(qū)域（如髓質(zhì)）引發(fā)的“晚期TCR信號”。這種晚期信號可能延遲了胸腺細胞的遷出，使其有更多時間暴露于由NKT2細胞產(chǎn)生的IL-4中，從而促進IM表型的獲得。
圖2 CD8Dual小鼠的表征
機制在野生型小鼠中的普適性
為了驗證這一機制并非CD8Dual小鼠特有，研究團隊在野生型BALB/c和C57BL/6（B6）小鼠中進行了驗證。在富含IL-4和NKT2細胞的BALB/c小鼠中，β5t的缺失同樣幾乎完全廢除了CV CD8+T細胞的生成，但不影響IM CD8+T細胞。而在缺乏IL-4、IM CD8+T細胞本就極少的B6小鼠中，β5t缺失也主要影響CV細胞的生成。這表明，不同胸腺肽選擇不同功能CD8+T細胞的機制是普遍存在的，而不同品系小鼠胸腺內(nèi)細胞因子環(huán)境（如IL-4水平）的差異決定了IM細胞群體的規(guī)模。
研究結(jié)論與意義
本研究得出了顛覆性的結(jié)論：CD8+T細胞的功能命運并非預先注定，而是在胸腺陽性選擇過程中，由特定MHC-I胸腺選擇肽通過調(diào)控TCR信號持續(xù)時間來精確決定的。β5t肽由于其局限于胸腺皮特的分布，其介導的TCR信號在胸腺細胞離開皮質(zhì)時必然中斷，從而專一性地產(chǎn)生細胞毒性CD8+T細胞。而非β5t肽因其在胸腺內(nèi)廣泛分布，使得TCR信號有可能持續(xù)（誘導輔助性命運）或在皮質(zhì)外重現(xiàn)（“晚期信號”，與IL-4協(xié)同誘導先天記憶命運）。因此，是肽在胸腺內(nèi)的“空間分布”特性，而非其絕對的序列特征，最終決定了其所選擇的CD8+T細胞的功能屬性。
這項研究成功地整合了T細胞識別的肽特異性、T細胞的功能獲得以及胸腺細胞的遷移過程這三個關鍵維度，為理解胸腺中CD8+T細胞功能異質(zhì)性的起源提供了全新的框架。它不僅深化了對T細胞發(fā)育生物學的認識，也對未來旨在定向調(diào)控T細胞功能（例如，在腫瘤免疫治療或自身免疫病干預中）的策略提供了重要的理論基礎。
參考資料
[1] Unraveling CD8 lineage decisions reveals that functionally distinct CD8+ T cells are selected by different MHC-I thymic peptides
