摘要：研究聚焦慢性腎臟病(CKD)中足細胞衰老的關(guān)鍵難題，揭示了血管緊張素II(Ang II)通過轉(zhuǎn)錄因子FOXA1下調(diào)磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，導(dǎo)致L-絲氨酸合成減少、線粒體功能障礙和細胞衰老的新機制。
在腎臟的微觀世界里，足細胞如同精巧的支架，支撐著腎小球的濾過屏障。這些高度分化的細胞一旦受損，就會引發(fā)蛋白質(zhì)泄漏，最終導(dǎo)致慢性腎臟病(CKD)的進展。其中，血管緊張素II(Ang II)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的核心成員，早已被證實是加速腎損傷的“罪魁禍首”。然而，科學(xué)家們一直困惑的是，Ang II究竟通過怎樣的精細機制，促使足細胞邁入衰老的深淵？以往的研究多聚焦于能量代謝紊亂，尤其是糖酵解的抑制，但僅僅恢復(fù)部分糖酵解通路并不能完全逆轉(zhuǎn)損傷，暗示著背后還隱藏著更深的代謝秘密。
近期，發(fā)表在《Nature Communications》上的一項研究揭開了這層神秘面紗。武漢大學(xué)人民醫(yī)院丁國華教授團隊發(fā)現(xiàn)，糖酵解通路中的一個關(guān)鍵酶——磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，其功能失調(diào)導(dǎo)致的L-絲氨酸合成不足，竟是驅(qū)動足細胞衰老的核心環(huán)節(jié)。這條名為“PGK1-絲氨酸-脫氧鞘脂”的代謝軸，為理解腎臟衰老提供了全新視角，也為干預(yù)CKD帶來了希望。
圖1 糖酵解途徑受損所致的絲氨酸代謝紊亂是足細胞衰老性損傷的關(guān)鍵驅(qū)動因素
研究人員綜合運用了多種關(guān)鍵技術(shù)方法開展此項研究。這包括：利用Ang II誘導(dǎo)的高血壓腎病(HN)小鼠模型、db/db 2型糖尿病腎病(DKD)小鼠模型和阿霉素(ADR)誘導(dǎo)的腎病小鼠模型進行在體功能驗證；通過人腎活檢組織（來源注明：武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準，包括健康對照和HN患者樣本）進行免疫組化、免疫熒光和臨床相關(guān)性分析；采用體外培養(yǎng)的永生化人足細胞(HPC)、小鼠足細胞(MPC-5)及原代足細胞模型進行機制探索；運用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建PGK1+/-基因敲低細胞系，并通過腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)的基因操作實現(xiàn)足細胞特異性PGK1過表達(PGK1podKI)和敲除(PGK1podKO)小鼠模型；通過代謝組學(xué)（包括非靶向代謝組學(xué)、氨基酸代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)）和轉(zhuǎn)錄組學(xué)(RNA-seq)進行全局性分子圖譜分析；采用海馬能量代謝分析系統(tǒng)檢測細胞耗氧率(OCR)和細胞外酸化率(ECAR)；利用表面等離子共振(SPR)、細胞熱位移分析(CETSA)、藥物親和反應(yīng)靶點穩(wěn)定性(DARTS)和分子對接等技術(shù)驗證蛋白質(zhì)-小分子直接相互作用；通過免疫共沉淀(Co-IP)和鄰近連接技術(shù)(PLA)驗證蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
Ang II誘導(dǎo)絲氨酸缺乏、足細胞損傷和細胞衰老
研究人員首先確認Ang II會破壞足細胞的糖酵解過程，并發(fā)現(xiàn)多種損傷刺激（高糖、Ang II、ADR）均導(dǎo)致足細胞內(nèi)的絲氨酸水平顯著下降。補充絲氨酸能有效改善線粒體形態(tài)和功能（如膜電位、ATP產(chǎn)量），減輕細胞骨架紊亂和脂質(zhì)積聚，并顯著降低衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性及衰老相關(guān)分泌表型(SASP)因子IL-1β和IL-6的分泌。這表明絲氨酸缺乏是Ang II誘導(dǎo)足細胞衰老的關(guān)鍵因素。
絲氨酸通過PI3K/AKT通路調(diào)控足細胞中脫氧鞘脂的產(chǎn)生
在機制探索中，研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸缺乏會顯著改變足細胞的整體代謝譜，其中脂質(zhì)代謝，尤其是鞘脂生物合成通路變化最為顯著。具體表現(xiàn)為毒性脫氧鞘脂（如1-脫氧鞘氨醇(DeoxySA)、脫氧二氫神經(jīng)酰胺(DeoxyDHCer)和脫氧神經(jīng)酰胺(DeoxyCer)）的積聚。這些脫氧鞘脂會以劑量依賴的方式加劇細胞骨架紊亂和細胞衰老。進一步的機制研究表明，絲氨酸能直接與PI3K的Thr462位點結(jié)合并增強其激酶活性，從而激活PI3K/AKT信號通路。使用PI3K激動劑740Y-P可以模擬絲氨酸的保護作用，緩解脫氧鞘脂積聚和細胞衰老。
PGK1表達在Ang II誘導(dǎo)的足細胞損傷中下調(diào)
絲氨酸的從頭合成依賴于糖酵解中間產(chǎn)物3-磷酸甘油酸(3-PG)，而PGK1正是催化1,3-二磷酸甘油酸(1,3-BPG)生成3-PG的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，在HN患者腎組織及Ang II處理的足細胞中，PGK1的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)。臨床數(shù)據(jù)分析顯示，較低的PGK1表達與更嚴重的蛋白尿、更高的尿白蛋白/肌酐比值(ACR)、更低的估算腎小球濾過率(eGFR)和更差的預(yù)后相關(guān)。
PGK1調(diào)控足細胞中的PI3K/AKT通路并與脫氧鞘脂積聚和細胞衰老相關(guān)
利用穩(wěn)定同位素13C6-D-葡萄糖標記技術(shù)，研究證實敲低PGK1確實會減少絲氨酸的合成，并影響三羧酸(TCA)循環(huán)。PGK1敲低還導(dǎo)致線粒體功能受損、細胞骨架紊亂、衰老標志物（p21, 8-OHdG）表達上調(diào)，并引起代謝組和轉(zhuǎn)錄組的顯著改變，其中鞘脂代謝和PI3K/AKT通路富集程度最高。而過表達PGK1則能逆轉(zhuǎn)上述病理變化。
PGK1穩(wěn)定KRT1
除了酶活性功能，研究還發(fā)現(xiàn)PGK1具有非酶功能。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PGK1與細胞角蛋白II型骨架1(KRT1)存在相互作用。實驗證實PGK1并不影響KRT1的mRNA表達，但能通過與KRT1蛋白結(jié)合，延緩其被蛋白酶體降解，從而起到穩(wěn)定KRT1、維持細胞骨架完整性的作用。功能域突變實驗進一步揭示，PGK1通過其K131和T168位點發(fā)揮酶活性調(diào)控絲氨酸代謝，而其200-360氨基酸區(qū)域則負責與KRT1結(jié)合，后者以不依賴酶活性的方式參與調(diào)控細胞衰老。
足細胞特異性過表達PGK1可減輕Ang II誘導(dǎo)的小鼠模型中的足細胞衰老
為了在體驗證PGK1的功能，研究者構(gòu)建了足細胞特異性過表達PGK1的小鼠(PGK1podKI)。在Ang II刺激下，PGK1podKI小鼠表現(xiàn)出更輕的腎功能損傷（較低的ACR、BUN、Cr）、更完整的足細胞結(jié)構(gòu)（WT1, SYNPO染色）、改善的線粒體呼吸功能，以及顯著減輕的衰老標志物表達和脫氧鞘脂積聚。通過AAV在成年小鼠腎臟原位過表達PGK1也能取得類似保護效果。
足細胞特異性敲除PGK1加劇Ang II誘導(dǎo)的小鼠模型中的足細胞衰老
相反，足細胞特異性敲除PGK1的小鼠(PGK1podKO)在Ang II刺激下，腎臟損傷和足細胞衰老表型均顯著加劇。使用PGK1特異性抑制劑Z57346765處理正常小鼠，也能重現(xiàn)Ang II加重足細胞衰老的效果，進一步證實了PGK1的關(guān)鍵保護作用。
FOXA1調(diào)控PGK1轉(zhuǎn)錄并在Ang II誘導(dǎo)的足細胞衰老中起保護作用
轉(zhuǎn)錄因子FOXA1能直接結(jié)合到PGK1基因的啟動子區(qū)域并促進其轉(zhuǎn)錄。在HN患者和Ang II處理的小鼠足細胞中，F(xiàn)OXA1的表達同樣下調(diào)。在足細胞中過表達FOXA1能部分依賴PGK1，緩解Ang II誘導(dǎo)的PI3K/AKT通路抑制、足細胞衰老和腎小球病理損傷。
補充絲氨酸可減輕Ang II誘導(dǎo)的小鼠模型中的足細胞衰老
究驗證了補充L-絲氨酸的治療潛力。在Ang II誘導(dǎo)的CKD小鼠模型中，口服補充絲氨酸能有效恢復(fù)腎臟功能，改善腎小球結(jié)構(gòu)和足細胞超微結(jié)構(gòu)，增強線粒體功能，激活PI3K/AKT通路，并降低衰老標志物和脫氧鞘脂水平。更重要的是，在db/db DKD小鼠和ADR腎病模型這兩種非Ang II誘導(dǎo)的CKD模型中，絲氨酸補充同樣顯示出保護作用，提示其治療策略具有廣譜潛力。
綜上所述，本研究系統(tǒng)闡明了一條全新的信號軸：Ang II通過抑制轉(zhuǎn)錄因子FOXA1，下調(diào)足細胞中PGK1的表達，導(dǎo)致糖酵解來源的L-絲氨酸合成減少。絲氨酸缺乏一方面無法通過激活PI3K/AKT通路來抑制毒性脫氧鞘脂的生成，另一方面PGK1減少也削弱了其穩(wěn)定KRT1以維持細胞骨架的能力，共同推動了足細胞的衰老進程。這項研究不僅深化了對足細胞損傷機制的理解，更重要的是將PGK1和絲氨酸代謝推向了CKD治療干預(yù)的潛在靶點位置。通過補充絲氨酸或靶向增強PGK1活性來重塑足細胞代謝穩(wěn)態(tài)，有望為延緩腎臟衰老、遏制CKD進展開辟新的治療途徑。
參考資料
[1] Impaired glycolysis-derived serine metabolism as a key driver of podocyte injury with senescence
摘要：研究聚焦慢性腎臟病(CKD)中足細胞衰老的關(guān)鍵難題，揭示了血管緊張素II(Ang II)通過轉(zhuǎn)錄因子FOXA1下調(diào)磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，導(dǎo)致L-絲氨酸合成減少、線粒體功能障礙和細胞衰老的新機制。
在腎臟的微觀世界里，足細胞如同精巧的支架，支撐著腎小球的濾過屏障。這些高度分化的細胞一旦受損，就會引發(fā)蛋白質(zhì)泄漏，最終導(dǎo)致慢性腎臟病(CKD)的進展。其中，血管緊張素II(Ang II)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的核心成員，早已被證實是加速腎損傷的“罪魁禍首”。然而，科學(xué)家們一直困惑的是，Ang II究竟通過怎樣的精細機制，促使足細胞邁入衰老的深淵？以往的研究多聚焦于能量代謝紊亂，尤其是糖酵解的抑制，但僅僅恢復(fù)部分糖酵解通路并不能完全逆轉(zhuǎn)損傷，暗示著背后還隱藏著更深的代謝秘密。
近期，發(fā)表在《Nature Communications》上的一項研究揭開了這層神秘面紗。武漢大學(xué)人民醫(yī)院丁國華教授團隊發(fā)現(xiàn)，糖酵解通路中的一個關(guān)鍵酶——磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，其功能失調(diào)導(dǎo)致的L-絲氨酸合成不足，竟是驅(qū)動足細胞衰老的核心環(huán)節(jié)。這條名為“PGK1-絲氨酸-脫氧鞘脂”的代謝軸，為理解腎臟衰老提供了全新視角，也為干預(yù)CKD帶來了希望。
圖1 糖酵解途徑受損所致的絲氨酸代謝紊亂是足細胞衰老性損傷的關(guān)鍵驅(qū)動因素
研究人員綜合運用了多種關(guān)鍵技術(shù)方法開展此項研究。這包括：利用Ang II誘導(dǎo)的高血壓腎病(HN)小鼠模型、db/db 2型糖尿病腎病(DKD)小鼠模型和阿霉素(ADR)誘導(dǎo)的腎病小鼠模型進行在體功能驗證；通過人腎活檢組織（來源注明：武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準，包括健康對照和HN患者樣本）進行免疫組化、免疫熒光和臨床相關(guān)性分析；采用體外培養(yǎng)的永生化人足細胞(HPC)、小鼠足細胞(MPC-5)及原代足細胞模型進行機制探索；運用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建PGK1+/-基因敲低細胞系，并通過腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)的基因操作實現(xiàn)足細胞特異性PGK1過表達(PGK1podKI)和敲除(PGK1podKO)小鼠模型；通過代謝組學(xué)（包括非靶向代謝組學(xué)、氨基酸代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)）和轉(zhuǎn)錄組學(xué)(RNA-seq)進行全局性分子圖譜分析；采用海馬能量代謝分析系統(tǒng)檢測細胞耗氧率(OCR)和細胞外酸化率(ECAR)；利用表面等離子共振(SPR)、細胞熱位移分析(CETSA)、藥物親和反應(yīng)靶點穩(wěn)定性(DARTS)和分子對接等技術(shù)驗證蛋白質(zhì)-小分子直接相互作用；通過免疫共沉淀(Co-IP)和鄰近連接技術(shù)(PLA)驗證蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
Ang II誘導(dǎo)絲氨酸缺乏、足細胞損傷和細胞衰老
研究人員首先確認Ang II會破壞足細胞的糖酵解過程，并發(fā)現(xiàn)多種損傷刺激（高糖、Ang II、ADR）均導(dǎo)致足細胞內(nèi)的絲氨酸水平顯著下降。補充絲氨酸能有效改善線粒體形態(tài)和功能（如膜電位、ATP產(chǎn)量），減輕細胞骨架紊亂和脂質(zhì)積聚，并顯著降低衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性及衰老相關(guān)分泌表型(SASP)因子IL-1β和IL-6的分泌。這表明絲氨酸缺乏是Ang II誘導(dǎo)足細胞衰老的關(guān)鍵因素。
絲氨酸通過PI3K/AKT通路調(diào)控足細胞中脫氧鞘脂的產(chǎn)生
在機制探索中，研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸缺乏會顯著改變足細胞的整體代謝譜，其中脂質(zhì)代謝，尤其是鞘脂生物合成通路變化最為顯著。具體表現(xiàn)為毒性脫氧鞘脂（如1-脫氧鞘氨醇(DeoxySA)、脫氧二氫神經(jīng)酰胺(DeoxyDHCer)和脫氧神經(jīng)酰胺(DeoxyCer)）的積聚。這些脫氧鞘脂會以劑量依賴的方式加劇細胞骨架紊亂和細胞衰老。進一步的機制研究表明，絲氨酸能直接與PI3K的Thr462位點結(jié)合并增強其激酶活性，從而激活PI3K/AKT信號通路。使用PI3K激動劑740Y-P可以模擬絲氨酸的保護作用，緩解脫氧鞘脂積聚和細胞衰老。
PGK1表達在Ang II誘導(dǎo)的足細胞損傷中下調(diào)
絲氨酸的從頭合成依賴于糖酵解中間產(chǎn)物3-磷酸甘油酸(3-PG)，而PGK1正是催化1,3-二磷酸甘油酸(1,3-BPG)生成3-PG的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，在HN患者腎組織及Ang II處理的足細胞中，PGK1的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)。臨床數(shù)據(jù)分析顯示，較低的PGK1表達與更嚴重的蛋白尿、更高的尿白蛋白/肌酐比值(ACR)、更低的估算腎小球濾過率(eGFR)和更差的預(yù)后相關(guān)。
PGK1調(diào)控足細胞中的PI3K/AKT通路并與脫氧鞘脂積聚和細胞衰老相關(guān)
利用穩(wěn)定同位素13C6-D-葡萄糖標記技術(shù)，研究證實敲低PGK1確實會減少絲氨酸的合成，并影響三羧酸(TCA)循環(huán)。PGK1敲低還導(dǎo)致線粒體功能受損、細胞骨架紊亂、衰老標志物（p21, 8-OHdG）表達上調(diào)，并引起代謝組和轉(zhuǎn)錄組的顯著改變，其中鞘脂代謝和PI3K/AKT通路富集程度最高。而過表達PGK1則能逆轉(zhuǎn)上述病理變化。
PGK1穩(wěn)定KRT1
除了酶活性功能，研究還發(fā)現(xiàn)PGK1具有非酶功能。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PGK1與細胞角蛋白II型骨架1(KRT1)存在相互作用。實驗證實PGK1并不影響KRT1的mRNA表達，但能通過與KRT1蛋白結(jié)合，延緩其被蛋白酶體降解，從而起到穩(wěn)定KRT1、維持細胞骨架完整性的作用。功能域突變實驗進一步揭示，PGK1通過其K131和T168位點發(fā)揮酶活性調(diào)控絲氨酸代謝，而其200-360氨基酸區(qū)域則負責與KRT1結(jié)合，后者以不依賴酶活性的方式參與調(diào)控細胞衰老。
足細胞特異性過表達PGK1可減輕Ang II誘導(dǎo)的小鼠模型中的足細胞衰老
為了在體驗證PGK1的功能，研究者構(gòu)建了足細胞特異性過表達PGK1的小鼠(PGK1podKI)。在Ang II刺激下，PGK1podKI小鼠表現(xiàn)出更輕的腎功能損傷（較低的ACR、BUN、Cr）、更完整的足細胞結(jié)構(gòu)（WT1, SYNPO染色）、改善的線粒體呼吸功能，以及顯著減輕的衰老標志物表達和脫氧鞘脂積聚。通過AAV在成年小鼠腎臟原位過表達PGK1也能取得類似保護效果。
足細胞特異性敲除PGK1加劇Ang II誘導(dǎo)的小鼠模型中的足細胞衰老
相反，足細胞特異性敲除PGK1的小鼠(PGK1podKO)在Ang II刺激下，腎臟損傷和足細胞衰老表型均顯著加劇。使用PGK1特異性抑制劑Z57346765處理正常小鼠，也能重現(xiàn)Ang II加重足細胞衰老的效果，進一步證實了PGK1的關(guān)鍵保護作用。
FOXA1調(diào)控PGK1轉(zhuǎn)錄并在Ang II誘導(dǎo)的足細胞衰老中起保護作用
轉(zhuǎn)錄因子FOXA1能直接結(jié)合到PGK1基因的啟動子區(qū)域并促進其轉(zhuǎn)錄。在HN患者和Ang II處理的小鼠足細胞中，F(xiàn)OXA1的表達同樣下調(diào)。在足細胞中過表達FOXA1能部分依賴PGK1，緩解Ang II誘導(dǎo)的PI3K/AKT通路抑制、足細胞衰老和腎小球病理損傷。
補充絲氨酸可減輕Ang II誘導(dǎo)的小鼠模型中的足細胞衰老
究驗證了補充L-絲氨酸的治療潛力。在Ang II誘導(dǎo)的CKD小鼠模型中，口服補充絲氨酸能有效恢復(fù)腎臟功能，改善腎小球結(jié)構(gòu)和足細胞超微結(jié)構(gòu)，增強線粒體功能，激活PI3K/AKT通路，并降低衰老標志物和脫氧鞘脂水平。更重要的是，在db/db DKD小鼠和ADR腎病模型這兩種非Ang II誘導(dǎo)的CKD模型中，絲氨酸補充同樣顯示出保護作用，提示其治療策略具有廣譜潛力。
綜上所述，本研究系統(tǒng)闡明了一條全新的信號軸：Ang II通過抑制轉(zhuǎn)錄因子FOXA1，下調(diào)足細胞中PGK1的表達，導(dǎo)致糖酵解來源的L-絲氨酸合成減少。絲氨酸缺乏一方面無法通過激活PI3K/AKT通路來抑制毒性脫氧鞘脂的生成，另一方面PGK1減少也削弱了其穩(wěn)定KRT1以維持細胞骨架的能力，共同推動了足細胞的衰老進程。這項研究不僅深化了對足細胞損傷機制的理解，更重要的是將PGK1和絲氨酸代謝推向了CKD治療干預(yù)的潛在靶點位置。通過補充絲氨酸或靶向增強PGK1活性來重塑足細胞代謝穩(wěn)態(tài)，有望為延緩腎臟衰老、遏制CKD進展開辟新的治療途徑。
參考資料
[1] Impaired glycolysis-derived serine metabolism as a key driver of podocyte injury with senescence
