摘要：本研究針對術(shù)后神經(jīng)認知障礙(PNCI)缺乏有效靶向治療的問題，開展了關于海馬區(qū)膠質(zhì)細胞異質(zhì)性及網(wǎng)絡通訊機制的單細胞測序研究。

隨著全球人口老齡化和外科技術(shù)的發(fā)展，接受手術(shù)治療的老年患者日益增多。然而，手術(shù)創(chuàng)傷和麻醉等因素使這一人群易患術(shù)后神經(jīng)認知障礙(PNCI)，這種并發(fā)癥嚴重影響患者康復進程和生活質(zhì)量。盡管PNCI具有重要的臨床意義，但其發(fā)病機制尚未完全闡明，且缺乏有效的靶向治療方法。海馬體作為學習和記憶的關鍵腦區(qū)，已被廣泛證實與術(shù)后認知功能障礙密切相關。 研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥是PNCI發(fā)生發(fā)展的關鍵致病驅(qū)動因素。作為CNS的常駐免疫細胞，小膠質(zhì)細胞在調(diào)節(jié)圍手術(shù)期炎癥和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著至關重要的作用。然而，圍手術(shù)期小膠質(zhì)細胞在PNCI發(fā)生發(fā)展中的貢獻、表型異質(zhì)性和通訊網(wǎng)絡仍特征不足。傳統(tǒng)上將小膠質(zhì)細胞簡單分為M1(神經(jīng)毒性和促炎)和M2(神經(jīng)保護和抗炎)表型的二分法已不能完全捕捉小膠質(zhì)細胞表型異質(zhì)性的復雜性。在阿爾茨海默病(AD)模型中，特定小膠質(zhì)細胞亞群——疾病相關小膠質(zhì)細胞(DAM)的特征已被描述，但在圍手術(shù)期海馬中小膠質(zhì)細胞特定亞群的作用及其激活過程中的表型異質(zhì)性仍知之甚少。

為了解決這些知識空白，鄭玉祥等研究人員在《Journal of Neuroinflammation》上發(fā)表了題為"Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment"的研究論文。該研究通過單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)，系統(tǒng)描繪了PNCI小鼠海馬區(qū)膠質(zhì)和血管細胞的全景圖譜，特別聚焦于小膠質(zhì)細胞的異質(zhì)性及其細胞間通訊網(wǎng)絡。 研究人員為開展本研究主要采用了以下幾個關鍵技術(shù)方法：使用18月齡老年小鼠建立PNCI模型并開展行為學測試；對對照組和手術(shù)組小鼠海馬組織進行單細胞RNA測序分析；通過免疫熒光結(jié)合熒光原位雜交(IF/FISH)驗證亞群數(shù)量和靶RNA轉(zhuǎn)錄本表達；利用透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)；采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測海馬TNF-α水平；通過Morris水迷宮和恐懼條件測試評估認知功能；應用TNF抑制劑依那西普進行干預研究。

研究人員對術(shù)后24小時的小鼠海馬組織進行scRNA-seq分析，共獲得20,684個海馬細胞，鑒定出10種細胞群，包括小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞(ECs)、神經(jīng)元等。聚焦于血腦屏障損傷、CNS炎癥和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有重要生物學功能的兩種膠質(zhì)細胞群和一種血管細胞群：小膠質(zhì)細胞(標記基因C1qc，對照組3,814個細胞，手術(shù)組4,776個細胞)、星形膠質(zhì)細胞(標記基因Aqp4，對照組1,183個細胞，手術(shù)組1,072個細胞)和內(nèi)皮細胞(標記基因Flt1，對照組150個細胞，手術(shù)組236個細胞)。

對8,590個海馬小膠質(zhì)細胞進行二次聚類分析，鑒定出八個轉(zhuǎn)錄不同的亞群：穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞(HM，占42%)、過渡狀態(tài)小膠質(zhì)細胞(TSM，占27%，表達即刻早期基因IEGs和炎癥基因)、炎癥相關小膠質(zhì)細胞(IAM，占12%，表達大量炎癥相關基因)、疾病相關小膠質(zhì)細胞(DAM，占6%)以及三個具有抗炎和神經(jīng)保護基因表達模式的亞群：炎癥抑制性小膠質(zhì)細胞(IIM，占6%)、代謝相關抑制性小膠質(zhì)細胞(MIM，占2%)和疾病相關抑制性小膠質(zhì)細胞(DIM，占1%)，其余4%為巨噬細胞。

手術(shù)組與對照組相比，小膠質(zhì)細胞亞群發(fā)生顯著變化：HM從術(shù)前的81%降至9.8%(下降88%)；TSM從1.4%增至47.8%(增加超過33倍)；IAM從1.3%增至21%(增加超過14倍)。這些發(fā)現(xiàn)表明手術(shù)后海馬小膠質(zhì)細胞穩(wěn)態(tài)被深刻破壞，向過渡狀態(tài)和炎癥相關激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變。

偽時間分析顯示，小膠質(zhì)細胞從HM開始，通過以即刻早期基因表達為特征的中間轉(zhuǎn)錄狀態(tài)(TSM)，隨后分化為兩個不同的分支：促炎(IAM)或抗炎(IIM)基因表達模式。基因共表達網(wǎng)絡分析確定了HM、TSM、IAM和IIM這些亞群功能的關鍵調(diào)控基因。

基于圍手術(shù)期小膠質(zhì)細胞亞群的變化，建立了小膠質(zhì)細胞激活相關信號通路。在IAM中，Tnf及其受體Tnfrsf1a均上調(diào)。促炎細胞因子Il1b通過TNF和NF-κB通路上調(diào)，導致促炎反應。Ccl2和Tspo在IAM中上調(diào)，而Hk2和Prkcd在DAM中升高。IF/FISH雙染證實手術(shù)組海馬中Tnf+IBA1+細胞(IAM)顯著增加。作為IAM的炎癥標記基因，Tnf、Tnfrsf1a和Il1b mRNA的熒光強度在手術(shù)組海馬小膠質(zhì)細胞中顯著升高。作為IAM的趨化因子和線粒體標記基因，Ccl2和Tspo mRNA的熒光強度也在海馬小膠質(zhì)細胞中升高。

聚類分析鑒定出六個不同的星形膠質(zhì)細胞亞群：穩(wěn)態(tài)星形膠質(zhì)細胞(HA，占36%)、血管生成相關星形膠質(zhì)細胞(AAA，占3%)、代謝相關星形膠質(zhì)細胞(MAA，占4%)、疾病和代謝相關星形膠質(zhì)細胞(DMA，占32%)、疾病相關抑制性星形膠質(zhì)細胞(DIA，占9%)和代謝相關抑制性星形膠質(zhì)細胞(MIA，占16%)。與微膠質(zhì)細胞相比，圍手術(shù)期星形膠質(zhì)細胞的變化不太明顯：手術(shù)組HA從術(shù)前39.6%降至32.6%(下降17.5%)，MIA從14.1%增至17.9%(增加26.9%)，其他亞群變化更不顯著。

CellChat分析顯示，手術(shù)后細胞間通訊增加，小膠質(zhì)細胞到小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞到星形膠質(zhì)細胞以及星形膠質(zhì)細胞到小膠質(zhì)細胞的信號顯著增強。在小膠質(zhì)細胞亞群中，IAM和TSM表現(xiàn)出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(shù)(IAM=91，TSM=85)和相互作用強度(均為2.7)。在星形膠質(zhì)細胞亞群中，HA和MAA表現(xiàn)出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(shù)(HA=135，MAA=111)和強度(HA=4.4，MAA=4.6)。隨后的IAM亞群分析顯示，在所有差異通路中，TNF信號在傳入和傳出相互作用強度方面增加最大。

對微膠質(zhì)細胞中上調(diào)的主要信號通路進一步分析發(fā)現(xiàn)，在TNF信號通路中，手術(shù)后IAM成為TNF信號的主要調(diào)節(jié)因子，作為TNF配體的主要來源、TNF相關信號的主要接收者和信號傳播中的關鍵中介。Tnf-Tnfrsf1a配體-受體(L-R)對通訊在手術(shù)組IAM中顯著增加。在BAFF通路中，手術(shù)后IAM通過同時產(chǎn)生BAFF配體、響應BAFF相關線索和參與微膠質(zhì)網(wǎng)絡中的信號中繼顯示出增強的參與。在CHEMERIN通路中，激活的IAM成為星形膠質(zhì)細胞源性CHEMERIN信號的主要接收者。在APP通路中，內(nèi)皮細胞作為APP相關信號的主要來源，主要靶向DIM。

基于已識別的微膠質(zhì)細胞亞群和細胞間通訊模式，建立了假設的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，顯示IAM通過升高的TNF信號在啟動炎癥中起關鍵作用，從而影響星形膠質(zhì)細胞反應和內(nèi)皮功能障礙。透射電子顯微鏡顯示手術(shù)后海馬血管超微結(jié)構(gòu)變化：內(nèi)皮細胞出現(xiàn)明顯的 cytoplasmic vacuolization 和基底膜碎片化，表明內(nèi)皮屏障損傷。

選擇臨床可用的TNF抑制劑依那西普(etanercept)靶向IAM驅(qū)動的炎癥。ELISA證實海馬TNF-α水平在手術(shù)組顯著增加，依那西普治療后有效抑制。IF/FISH驗證了調(diào)節(jié)網(wǎng)絡主要功能基因的表達：炎癥基因Tnf、Ccl2和Il1b在手術(shù)組海馬小膠質(zhì)細胞中顯著上調(diào)，而TNF抑制劑將其表達降低至基線水平。免疫熒光證實TNF-α蛋白表達也在手術(shù)組小膠質(zhì)細胞中增加，TNF抑制劑將其表達降低至基線。Egr1和C1qa在星形膠質(zhì)細胞中顯著上調(diào)，Icam1和Iftm3在手術(shù)組血管內(nèi)皮細胞中顯著上調(diào)，TNF抑制劑將其表達降低至基線。

通過Morris水迷宮(MWM)和恐懼條件測試(FCT)評估老年小鼠手術(shù)后和TNF抑制后的認知功能。在MWM測試中，逃避潛伏期在對照組隨著訓練進行顯著減少，這種趨勢在手術(shù)組不太明顯，TNF抑制劑治療可挽救這種缺陷。空間記憶通過平臺穿越次數(shù)和在目標象限停留時間評估，手術(shù)后受損，TNF抑制劑治療可挽救。在FCT中，海馬依賴的情景記憶在手術(shù)后1天和5天顯著受損，TNF抑制劑治療挽救了這些情境認知障礙。對于海馬非依賴的語調(diào)認知，兩組方差分析顯示治療(依那西普vs鹽水)和條件(對照vs手術(shù))之間沒有顯著交互作用。

本研究提供了PNCI小鼠海馬膠質(zhì)和血管細胞群的單細胞圖譜，揭示了八個微膠質(zhì)細胞亞群。其中，擴增的IAM表現(xiàn)出與膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞增強的網(wǎng)絡通訊，通過TNF介導的信號傳導促進海馬炎癥。此外，TNF抑制減輕了術(shù)后微膠質(zhì)細胞激活和認知障礙。這些發(fā)現(xiàn)突出了海馬IAM作為PNCI預防和治療的關鍵致病驅(qū)動因素和有前景的治療靶點。

該研究的創(chuàng)新之處在于首次在圍手術(shù)期背景下系統(tǒng)描繪了海馬區(qū)微膠質(zhì)細胞的異質(zhì)性圖譜，特別是發(fā)現(xiàn)了IAM這一關鍵亞群在PNCI中的核心作用。不同于神經(jīng)退行性疾病中觀察到的慢性激活，圍手術(shù)期微膠質(zhì)細胞激活是短暫而強烈的，術(shù)后24小時即觀察到IAM增加。這種急性微膠質(zhì)細胞激活可能啟動長期的神經(jīng)炎癥和進行性神經(jīng)元功能障礙，導致長期認知障礙。

研究還揭示了微膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞共同構(gòu)成膠質(zhì)血管單元(GVU)，在神經(jīng)退行性疾病進展中調(diào)節(jié)血腦屏障功能和CNS穩(wěn)態(tài)中起著不可或缺的作用。在GVU內(nèi)，微膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞與腦血管保持密切的空間接近。研究表明，術(shù)后IAM的擴增與星形膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞的通訊增強相關。IAM誘導反應性星形膠質(zhì)細胞表型，進一步塑造炎癥微環(huán)境。微膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞之間的雙向相互作用，以及內(nèi)皮功能障礙，形成維持神經(jīng)炎癥的病理循環(huán)。

該研究為PNCI的防治提供了新的思路和靶點?？刂莆⒛z質(zhì)細胞激活和減輕CNS炎癥已被確定為AD、缺血性中風和創(chuàng)傷性腦損傷的有前景的治療策略。研究表明，靶向IAM通過TNF信號干預具有治療潛力。臨床試驗也顯示TNF抑制劑在AD患者中的安全性、耐受性和潛在認知益處。然而，這種干預仍然是超適應癥使用，TNF抑制劑在PNCI和神經(jīng)退行性疾病患者中的使用仍需進一步研究。

總之，這項研究不僅深化了對PNCI發(fā)病機制的理解，而且為開發(fā)針對特定微膠質(zhì)細胞亞群的精準治療策略提供了重要依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床轉(zhuǎn)化價值。

[1] Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment